今日自闭症自闭症谱系障碍（ASD）包括一系列的神经发育疾病。单个ASD基因的不同突变导致了疾病表型的异质性，可能是由于所产生的亚型的功能多样性。SHANK2是ASD的致病基因，但缺乏以亚型特异性方式研究内源性SHANK2蛋白的工具。
基于此，2024年5月4日暨南大学师玲玲研究团队在Molecular Psychiatry杂志发表了“Autism patient-derived SHANK2BY29Xmutation affects the development of ALDH1A1 negative dopamine neuron”揭示了自闭症患者来源的SHANK2BY29X突变影响ALDH1A1阴性多巴胺神经元的发育。
作者探究了一个在一例自闭症患者中发现SHANK2的点突变，位于SHANK2B转录变异（NM_133266.5）的外显子上。该突变导致一个早期终止密码子和一个异常剪接事件，明显影响SHANK2转录变异。携带这种突变的诱导多能干细胞（iPSCs），从患者或等基因编辑中，不能分化为功能性多巴胺（DA）神经元，这可以通过基因校正来挽救。现有的来自人类中脑的SMART-Seq单细胞数据显示，在ALDH1A1阴性的DA神经元中有大量的SHANK2B转录本。然后作者发现，在体外神经元发育的早期阶段，SHANK2BY29X突变主要影响SHANK2B的表达和ALDH1A1阴性的DA神经元。敲除相同突变的小鼠表现出类似自闭症的行为，腹侧被盖区（VTA）的多巴胺释放减少。
图一 SHANK2BY29X载体在DA神经元分化、树突形态和功能方面存在缺陷
作者收集了一个7岁时被诊断为自闭症个体的信息，该患者表现触一系列刻板的行为，他还表现出轻微的智力残疾。在SHANK2（NM_133266.5）上发现了一个从头异质突变c.87C>G，这是ASD的主要风险基因。通过对WGS数据分析证实了该变异是一个候选突变，在SHANK2B转录本变异第1外显子的一个等位基因上发生C到G单核苷酸突变，导致一个过早终止密码子，产生SHANK2B p。为了探索由SHANK2BY29X突变导致的ASD相关的细胞表型，首先将来自先证者及其未受影响的父亲的PBMCs重编程为iPSCs。这些患者分别被称为患者克隆（PC）和健康克隆（HC）。作者利用ipscs-神经元模型阐明SHANK2BY29X突变对神经元发育的影响。作者观察到PC系的神经元分化率显著降低HC线。同时，TH阳性/MAP2阳性DA群体显著减少，这些表型在PC1-res细胞系中得到挽救。此外，当检测两组亚型神经元的树突分枝时，发现与HC系相比，PC系中DA神经元的树突长度和分枝明显减少。然而，谷氨酸能神经元的树突状形态仅显示出适度的下降，而GABA能神经元的数量保持不变。电生理分析发现，PC1来源的DA神经元的膜电阻降低，细胞电容增加，峰值钠离子（INa）阈值升高，INa电流降低。这些异常在PC1-res1细胞中得到了挽救。结果表明，SHANK2BY29X突变同时影响DA的分化、树突状形态和神经元的活性。
图二 SHANK2BY29X优先影响ALDH1A1阴性DA神经元
SHANK2基因可以产生多种转录本，不同的蛋白亚型可能具有特定的功能。SHANK2B保留了PDZ结构域，对神经发育至关重要。作者首先通过western blot验证了PC1来源的神经元中SHANK2B的缺失，使用亚型敏感的BaseScope探针进一步证明了RNA水平上不同亚型的变化。结果显示，在PC1来源的神经元中，SHANK2B转录本减少，而SHANK2E转录本保持不变，而这种减少在PC1-res1细胞系中可以被挽救。与TH共染色可以显示患者源性DA神经元中SHANK2B表达降低。此外，在从NPCs分化的5天的神经元中微弱检测到SHANK2A信号，但在iPSCs阶段更明显。大量RNA测序显示，在神经元早期阶段，SHANK2和SHANK2B的转录本表达降低。使用两种不同的引物进行qRT-PCR，SHANK2A和SHANK2E转录本明显增加，而SHANK2B则降低。这些证据表明，与未受影响的父系克隆（HC1）相比，ASD患者克隆（PC1）诱导的神经元中SHANK2B的RNA和蛋白水平显著降低，而SHANK2E和SHANK2A在不同发育阶段保持不变或可能代偿性增加。通过ALDH1A1和TH共染色发现，SHANK2 c.87C>G突变明显影响了hDA1的树突长度和复杂性，而在ALDH1A1阳性的TH阳性的hDA2神经元中，只观察到树突分枝的细微变化。
图三 SHANK2BY29XKI小鼠在VTA中表现出异常的社交行为和DA神经元缺陷
作者运用SHANK2BY29XKI小鼠研究SHANK2BY29X如何在细胞和行为水平上影响体内大脑发育。通过CRISPR/Cas9技术和同源重组，将Y28X（对应于人Y29X）敲入内源性Shank2位点。接下来探讨纯合子KI小鼠是否被授予自闭症样表型。在三箱社交实验中，WT小鼠表现出对陌生鼠的偏好，而KI小鼠在第二阶段没有表现出明显的倾向，表明KI小鼠表现出社交能力的缺陷。作者还注意到KI小鼠表现出异常的刻板行为、多动、焦虑和空间学习和记忆受损能力。总之，作者证明了SHANK2 c.87C>G突变是一种致病性突变，它在小鼠中诱导类似自闭症的行为中是十分必要的。作者通过蛋白印迹证实小鼠VTA中SHANK2BY29X突变带来的SHANK2B蛋白亚型缺失和TH表达减少。在解剖水平上，中脑DA的两个主要群体分别位于SN和VTA。帕金森病引起的DA神经退行性变主要发生在大多数Aldh1a1阳性DA神经元所在的SN。通过FSCV探测到的NAc中TH的平均荧光强度以及电刺激诱导的NAc释放在KI小鼠中显著减少。因此，内源性SHANK2B的表达不仅在VTA中多巴胺神经元的发育中，而且在基于多巴胺的脑回路的建立中具有重要作用。
总结：
作者的研究首次证实了SHANK2B在阴性的ALDH1A1DA神经元中的亚型特异性表达，其中来自ASD患者的SHANK2B功能缺失突变损害了其在体外的生长和功能。
